KLT kromatografi lapis tipis

Percobaan ini bertujuan untuk memisahkan komponen-komponen dari kulit batang kemiri dan untuk menentukan perbandingan eluen yang dapat menghasilkan pemisahan yang bagus.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning.
Sampel yang dipisahkan merupakan fraksi n-heksan, fraksi etil asetat, dan fraksi n-butanol dari ekstrak kulit batang kemiri. Sedangkan pelarut yang digunakan sebagai eluen adalah n-heksan, etil asetat, kloroform, metanol, dan air. Eluen yang digunakan merupakan pencampuran dari pelarut tersebut. Eluen yang dibuat adalah perbandingan n-heksan : etil asetat adalah perbandingan 6:4, 7:3, dan 9:1, sedangkan perbandingan kloroform : metanol : air yang digunakan adalah 10:6:0,5. Pada fraksi etil asetat dan n-heksan menggunakan eluen campuran keduanya. Sedangkan pada fraksi n-butanol menggunakan eluen kloroform : metanol : air.
Tiap fraksi-fraksi ekstrak yang terdapat dalam botol vial dilarutkan dengan kloroform/metanol dengan perbandingan 1:1. Penambahan ini bertujuan agar hasil pencampuran tiap fraksi ekstrak menjadi agak non polar, karena kloroform merupakan non polar dan metanol adalah semi polar, sehingga pada saat penotolan diharapkan hasil yang baik dikarenakan tingkat kepolaran yang seimbang.
Setelah membuat eluen yang akan digunakan dilanjutkan dengan menyiapkan plat KLT yaitu dengan memotongnya sesuai dengan panjang 7,5 cm dan lebar 2 cm. Dan kemudian dibuat batas bawah dan atasnya agar mudah untuk menghitung Rfnya. Batas bawah yang dibuat adalah 1 cm dan batas atas adalah ½ cm. batas bawah dan batas atas ini dibuat dengan menggunakan pensil. Sebuah garis menggunakan pensil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan.
Sebagai penanda batas atas dan batas bawah fase diam (yang akan dilalui eluen) digunakan pensil, karena pensil mengandung senyawa karbon yang tidak larut dalam eluen. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk, oleh karena itu digunakan pensil sebagai penandanya. Batas bawah diberi garis 1 cm dan bagian atas 1/2 cm. Dimana eluen yang digunakan tidak boleh lebih dari 1 cm, hal ini dikarenakan sesuai dengan prinsip kapilaritas, yaitu untuk menaikkan spot (ascending). Kapilaritas adalah naiknya cairan eluen melalui pori-pori kapiler lempeng. Penotolan biasanya dilakukan menggunakan pipa kapiler kaca tetapi dapat pula dilakukan penyemprotan atau alat otomatis. Lalu pelarut dibiarkan menguap atau dihilangkan dengan bantuan aliran udara kering. Selanjutnya lapisan dimaksudkan ke bejana pengembang sesuai dengan fraksi dan perbandingan masing-masing.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna. Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.
Deteksi bercak digunakan 2 cara, yaitu fisika dan kimia. Untuk cara fisika, digunakan sinar UV. Sejumlah senyawa alam akan berflouresensi yaitu memancarkan cahaya tampak saat dikenai sinar UV atau mengabsorpsi sinar UV. Senyawa yang mengabsorpsi sinar UV akan tampak sebagai daerah gelap di bawah UV. Oleh kerana itu digunakan sinar UV dengan tujuannya untuk mendeteksi senyawa yang dapat berfluoresensi, dimana senyawa tersebut memiliki gugus khromofor. Gugus khromofor merupakan gugus yang dapat memberi atau menghasilkan warna. UV digunakan dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Panjang gelombang 254 nm tujuannya untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap. Sedangkan jika dibawah panjang gelombang 366 nm untuk menampakkan bercak yang berfluoresensi sehingga pada pengamatan terlihat bercak berpendar (memancarkan cahaya).
Keuntungan menggunakan UV ialah karena sinar UV tidak merusak senyawa yang dideteksi, sehingga hasil kromatografi dapat kembali digunakan.
Sedangkan untuk cara kimia, yaitu dengan mereaksikan bercak menggunakan asam sulfat pekat melalui cara penyemprotan lalu dipanaskan dengan tujuan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang tampak sebagai bercak hitam kecoklatan. Adanya warna hitam kecoklatan itu menunjukkan adanya senyawa organik pada sampel. Asam sulfat bersifar membakar. Hal ini dimaksudkan untuk mendeteksi senyawa karbon. Hal ini dibuktikan dengan munculnya warna coklat kehitaman. H2SO4 memutuskan ikatan rangkap, sehingga yang terlihat adalah karbonnya.
Pada proses pendeteksian dengan menggunakan sinar UV terlihat bercak pada lempeng silika gel tampak berekor. Hal ini disebabkan karena sampel masih mengandung air dimana pada proses pemisahan kurang sempurna.
Dari hasil pengamatan dapat dilihat pada fraksi n-hexan dengan eluen n-hexan dan etil asetat dengan perbandingan 6:4 menghasilkan noda yang berekor dan tidak terpisah sehingga perbandingan eluennya harus dikecilkan. Hal yang sama terjadi dengan fraksi yang lain dengan eluen yang berbeda-beda perbandingannya menghasilkan spot yang berekor dan senyawa yang tidak terpisah kecuali pada fraksi n-hexan dengan eluen n-hexan dan etil asetat dengan perbandingan 7:3 yang menghasilkan spot yang tidak berekor dan senyawa yang terpisah. Eluen yang baik pada percobaan kali ini adalah fraksi n heksan : etil asetat dengan perbandingan 7:3, karena senyawa-senyawa yang terlarut oleh pelarutnya terpisah dengan baik membentuk spot-spot yang berada di tengah.
Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.
Cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung pada kelarutan senyawa dalam pelarut, hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut. Serta bagaimana senyawa melekat pada fase diam, dalam hal ini gel silika, tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan gel silika.
Warna yang terbentuk pada saat pelarutan lebih banyak pada ekstrak n-hexan daripada ekstrak etil asetat. Hal ini dikarenakan senyawa kulit batang kemiri lebih banyak yang tertarik ke pelarut n-hexan daripada etil asetat. Ini menunjukkan bahwa senyawa dalam kulit batang kemiri lebih banyak yang bersifat non polar.


G. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan :
1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya yag dapat digunakan untuk memisahkan senyawa- senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.
2. Kulit batang kemiri sebagian besar terkandung senyawa non polar. Hal ini dikarenakan banyaknya warna pada fraksi n-heksan.